夏宇塵教授課題組乙肝病毒動物模型研究再獲突破

2022-06-27 13:12:38
近日,武漢大學泰康醫學院(基礎醫學院)醫學病毒學研究所/病毒學國家重點實驗室夏宇塵教授課題組在國際肝臟病學權威期刊Hepatology(《肝臟病學》)發表最新研究成果。該研究系統性地探究了乙型肝炎病毒(HBV)進入人和小鼠肝細胞后的過程,發現細胞質中HBV核衣殼的解離限制了病毒在小鼠肝細胞中的感染,為建立支持HBV感染的小鼠模型提供了分子基礎。

論文題目為“Limited disassembly ofcytoplasmichepatitisB virus nucleocapsidsrestricts viral infectionin murine hepatic cells”(《乙肝病毒由于胞質中核衣殼解聚受限不能在小鼠肝細胞中建立感染》)。博士后趙凱濤為論文第一作者,夏宇塵為通訊作者。

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)屬于嗜肝DNA病毒,主要感染人的肝細胞,其慢性感染可顯著提高肝硬化和肝癌的發病率。據世界衛生組織報道,全球約有2.57億人正遭受著HBV感染的困擾。中國是HBV感染的高發區,在新發人數下降的情況下,仍然有7千萬感染者。針對慢性乙肝,目前臨床上主要有干擾素α和核苷類似物兩類藥物。這些藥物雖然可以有效抑制HBV的復制并減緩疾病進程,但不能徹底治愈慢性乙型肝炎,主要原因是現有藥物無法清除HBV感染細胞后形成的微染色體cccDNA。由于缺少簡便易操作的動物感染模型,HBV相關機制研究和藥物研發受到了很大的阻礙。夏宇塵課題組前期建立了基于復制缺陷型AAV-HBV新型HBVcccDNA小鼠模型(Xu et al. CMGH, 2022),本研究聚焦于HBV不能在小鼠肝細胞中建立感染的原因。

早期研究顯示小鼠作為最常用的小型實驗動物并不支持HBV感染。將HBV受體人源?;悄懰徕c共轉移多肽(hNTCP)在小鼠肝細胞中表達可以支持HBV感染進入小鼠肝細胞,但仍不能成功建立HBV感染。為探究HBV在小鼠肝細胞中具體的受限制步驟,研究人員構建了hNTCP的轉基因小鼠及穩定表達hNTCP的小鼠肝癌細胞系Hepa1-6-hNTCP,可以支持HBV感染的人肝癌細胞系Huh7-hNTCP作為陽性對照。通過HBV/HDV(hepatitisdeltavirus,丁型肝炎病毒,HBV的衛星病毒,利用hNTCP感染肝細胞)感染及轉染體外合成的pgRNA,首先證實了HBV可以利用hNTCP感染進入小鼠肝細胞,但不能形成cccDNA。同時,研究人員利用體外合成的cccDNA分子、工程菌中合成的重組cccDNA分子及HBV復制型質粒證實了HBV的轉錄可以在小鼠肝細胞中正常進行。

為了研究HBV基因組rcDNA修復形成cccDNA的過程,研究人員在體外合成了rcDNA的不同修復中間體分子及從HBV病毒顆粒中抽提病毒來源的rcDNA分子,利用了rcDNA的體外修復體系及小鼠高壓尾靜脈注射模型,結果表明小鼠肝細胞可以支持rcDNA修復形成cccDNA。RcDNA修復形成cccDNA的場所是細胞核,因此研究人員利用核酸原位雜交技術探究小鼠細胞中rcDNA的入核過程是否受限,結果顯示HBV基因組rcDNA可以被轉運至小鼠肝細胞的細胞核。此結果在后續的Southernblotting實驗中也得到了進一步驗證。

以上結果顯示,小鼠肝細胞支持HBV基因組rcDNA的核轉運及rcDNA分子修復形成cccDNA,這也提示HBV核衣殼的解離可能受到了限制。為驗證這一假說,研究人員首先通過Southernblotting檢測了HBV在小鼠肝細胞中感染不同時相的HBV不同類型DNA分子的存在及位置,發現非蛋白結合的rcDNA(protein-free rcDNA,PF-rcDNA,此類型rcDNA被認為是cccDNA合成的前體分子)可以在小鼠肝細胞核中檢測到,但只短暫地存在于病毒感染的早期。

進一步通過核酸酶敏感實驗對HBV核衣殼完整性進行分析發現,小鼠肝細胞中無論是細胞質還是細胞核PF-rcDNA的核酸酶敏感性與人肝癌細胞系Huh7-hNTCP類似:絕大部分的細胞質及細胞核PF-rcDNA對核酸酶DNaseI處理敏感,少量PF-rcDNA耐受DNaseI的處理;與Huh7-hNTCP細胞不同的是,Hepa1-6-hNTCP細胞質中蛋白結合的rcDNA(protein-linked rcDNA,P-rcDNA,主要指HBV聚合酶蛋白Pol共價結合的rcDNA)表現出對DNaseI處理完全的耐受性,表明小鼠肝細胞質中的核衣殼解離受到限制。

綜上所述,該研究進一步揭示了小鼠肝細胞除了缺少病毒進入受體之外,在其細胞質中病毒核衣殼無法解離是限制HBV感染的一個重要原因,為建立支持HBV感染的小鼠模型提供了分子基礎。

夏宇塵自2018年通過海外高層次人才計劃回國后一直致力于病毒性肝炎的研究,作為通訊作者在Journal of Hepatology,Hepatology,Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology,Journal of Virology等學術期刊發表多篇論文。

該研究工作得到國家自然科學基金(81971936,32100125)、吉利德亞洲肝病研究基金、中央高?;究蒲袠I務費專項資金、湖北省醫學青年拔尖人才、湖北省創新研究群體(2020CFA015)、湖北省衛健委創新群體(WJ2021C002)、中國博士后科學基金(2020M672419)等項目資助。(來源:武漢大學)

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